La technologie CRISPR/Cas9 a amélioré la capacité à introduire des modifications ciblées dans les cellules et les embryons de diverses espèces. L’utilisation de cette technologie permet d’établir des modèles d’élevage génétiquement modifiés pour étudier les maladies humaines ou améliorer la manufacturing alimentaire. Cependant, l’une des principales préoccupations liées à l’emploi de cette technologie est la possibilité d’introduire des modifications involontaires du génome induites par le Streptocoque pyogène Cas9 (SpCas9), une protéine Cas9 couramment utilisée. Les progrès récents de la technologie CRISPR/Cas9 offrent des variantes de Cas9 conçues pour améliorer la spécificité de l’édition génétique.
Objectif: Ici, trois variantes SpCas9 haute fidélité (eSpCas9, HiFi Cas9 et LZ3 Cas9) ont été utilisées pour examiner leur efficacité et leur spécificité chez les embryons de porc.
Méthodes : Pour introduire des modifications ciblées, l’ARNm codant pour chaque variante de Cas9 a été mélangé avec de l’ARN information distinctive IGH (sgRNA) et injecté dans des zygotes de porc fécondés. La fréquence de ciblage et de non-ciblage a été calculée en amplifiant les régions IGH, AR et RBFOX1 à partir de l’ADN génomique dérivé des embryons injectés au stade du blastocyste et envoyés pour séquençage Sanger.
Résultats: Le sgRNA ciblant le locus IGH a entraîné un taux d’édition sur cible de 100 % en utilisant SpCas9. Cependant, SpCas9 a introduit des événements non ciblés dans AR et RBFOX1 à une fréquence élevée (> 60 %) chez les embryons. L’injection de chaque variant Cas9 à raison de 20 ng/µl pourrait modifier le gène cible (IGH) avec une efficacité de 100 % sauf pour LZ3 Cas9 (59,1 %). Il est necessary de noter que les événements hors cible sur AR et RBFOX1 n’ont été détectés dans aucun groupe de variantes Cas9. La réduction progressive de la focus d’ARNm Cas9 a réduit l’efficacité du ciblage dans tous les groupes ; cependant, la réduction a été plus spectaculaire dans les embryons injectés par HiFi Cas9 et LZ3 Cas9. Aucune toxicité embryonnaire n’a été identifiée chez les embryons injectés avec des variantes de Cas9 et davantage d’embryons ont atteint le stade de blastocyste lorsqu’ils ont reçu une injection d’ARNm d’eSpCas9 ou de HiFiCas9. La compétence in vivo des embryons recevant eSpCas9 a été examinée par transfert d’embryons et les fœtus récupérés sur une truie gestante ont présenté une efficacité d’édition sur cible de 100 % sans aucun événement hors cible détectable.
Conclusion: En résumé, parmi les variantes de Cas9 examinées, eSpCas9 présentait la spécificité la plus élevée sans événements hors cible détectables et soutenait le développement de fœtus génétiquement modifiés. Nos résultats indiquent que l’utilisation de variantes Cas9 peut faire progresser le domaine de l’édition génétique dans les modèles d’élevage.
Kim J, Yoon J, Chen J, Lee J, Lee HJ, Whitworth Okay, Redel B, Prather RS, Lee Okay. Améliorer la spécificité des résultats de l’édition génétique en utilisant des variantes Cas9 dans des embryons porcins, Journal of Animal Science, Quantity 104, 2026, skag030.
https://doi.org/10.1093/jas/skag030